陈九畴，字禹学，曹州人。风流倜傥，多有权谋韬略。自从作为诸生，就练习武事。弘治十五年(1502)考中进士。授官刑部主事。有重罪囚徒越狱，无人敢捉，陈九畴手执长矛追赶并抓到犯人，于是以武健出名。
正德初年，他审查囚犯记录于南畿，忤逆刘瑾，被贬为阳山知县。刘瑾败落，陈九畴恢复旧职，历任郎中，调迁肃州兵备使。总督彭泽决定贿赂吐鲁番方面，他派遣哈密都督写亦虎仙前往实行。陈九畴激动地说：“彭公受天子之命，节制边疆，不能身当利害，为何这般没有原则啊！”于是操练队伍士兵，修缮营垒，经常如临大敌。写亦虎仙果然暗通敌贼。番酋速檀满速儿侵犯嘉谷关，游击芮宁败死。不久吐鲁番方面又派遣斩巴思等人用骆驼马匹求和，但暗中派人给写亦虎仙和他的同党阿刺思罕儿、失拜烟答等人送信，让他们作为内应。陈九畴知道乱贼的计谋，抓住阿刺思罕儿和斩巴思送进监狱。命通事毛鉴等人看守他们。毛鉴等人过去与他们有联系，想放他们离去，众番都伺隙谋变。陈九畴发现了这些情况，杀了毛鉴等人。敌贼失去内应，于是拔帐逃走。兵部尚书王琼厌恶彭泽，并且追究陈九畴的失事罪，逮捕拘囚于法司监狱。以失拜烟答死于狱中为罪名，在官籍中除去了他的名字。
世宗即位后，以原职起用陈九畴。不久升为陕西按察使。过了数月，甘肃总兵官李隆怂恿部下殴打杀死巡抚许铭，并焚烧他的尸体。于是升陈九畴为右佥都御史，巡抚甘肃，按验许铭之事，诛李隆和乱兵生事的头头。陈九畴抵达甘肃镇，说额定军兵七万多人，现在有的不到一半，并且多是老弱之人，请求允许下令招募。皇帝下诏批准。
嘉靖三年(1524)，速檀满速儿又用二万多骑兵围攻肃州。陈九畴从甘州昼夜奔驰入城，射击敌贼，敌贼死伤甚多。之后，又出兵追击。攻掠甘州的部分敌贼，也被总兵官姜打败。根据战功，陈九畴升职为副都御史，并赐给他金币。陈九畴向皇帝上奏说“：番贼敢入犯我边境，是因为我们收纳他们的朝贡，任其商贩，使得他们熟悉我们的虚实。写亦虎仙的逆谋已经暴露，但他贿赂权贵，反而能蒙宠幸，以犯边之寇，为来贡宾客。边臣因利害方面的恐惧，拱手听命，致使内属与番人勾连接应，以至于今。现在即使不能像汉武帝那样兴大宛之师，也应当效法光武帝那样隔绝西域的计谋。先后入贡没有归去的人有两百多，应该将他们安置到两粤，对其中有谋逆迹象的或加刑或杀戮，那么敌贼就没有内应作为依靠，必然不再有侵略袭击。倘若再包含隐忍，恐怕河西十五个卫所，将永远没有安宁的日子。”奏事下达之后，总督杨一清颇采纳他的建议。四年春天，退职归乡。
开始，吐鲁番失败逃遁，都指挥王辅说速檀满速儿和牙木兰都被炮打死，陈九畴以此上报。后来他们二人上表请求进贡。皇帝感到奇怪并且怀疑他们。而番人先在京师散布流言蜚语，说肃州的围困，是由陈九畴激发的，皇帝更加相信。正巧百户王邦奇揭发杨廷和、彭泽的短处，言词牵连到陈九畴。吏部尚书桂萼等人想利用陈九畴来排挤彭泽，因而请允许通贡，从而追究整治陈九畴激发变乱之事。大学士杨一清说事情在前已有决定。皇帝不听，逮捕陈九畴下诏狱。刑部尚书胡世宁在朝廷上说“：世宁掌管刑法而杀忠臣，宁可杀世宁。”于是上疏为陈九畴鸣冤说：“番人诈变，妄图传递诽谤怨言，想加害我方的谋臣。他们畜谋内寇，为日已久。一旦拥兵深入，诸番约定为内应，不是陈九畴先机奋身而起，并且近派属下夷民退却他们的营帐，远交瓦刺扰乱他们的巢窟，使他们内顾而返，那么肃州这座孤城怎么又能保得住呢？臣认为文臣里面的有勇知兵忘身殉国的人，无人能比得上陈九畴，无怪番人很惧怕而想杀他呢。只是他听信部下兵卒的妄报，以为满速儿已死，那么他才有其不免之罪。”之后，法司陈述案件也像胡世宁所说的一样。皇帝终于还是听信桂萼等人的话，将陈九畴贬戍于远边。在那里生活了十年，陈九畴才遇赦返回内地。
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